Natalie Portman nasce a Gerusalemme da un padre medico e una madre artista. All'età di tre anni si trasferisce con la famiglia a Washington e successivamente a Syosset, dove si stabilisce definitivamente. Sempre in questa città frequenta la Syosset High School dove riscuote buoni voti soprattutto in matematica. Parla correntemente l'ebraico e l'inglese e conosce più o meno bene francese, tedesco e giapponese.
Inizia a studiare danza all'età di quattro anni. Inizia la carriera come modella, ma nel 1994 le viene offerta una parte nel film Léon di Luc Besson. Quel film le frutterà altri lavori di recitazione che svolgerà durante i periodo estivo per non rinunciare a scuola ed università. I film in cui appare in questo periodo sono: Heat - La sfida (1995) di Michael Mann, con Al Pacino e Robert De Niro, Tutti dicono I Love You (1996) di Woody Allen, con Edward Norton e Drew Barrymore, e Mars Attacks (1996) di Tim Burton, questa volta con Jack Nicholson e Glenn Close.
Attrice attenta alla scelta delle parti che interpreta, predilige ruoli positivi in modo che le ragazze sue ammiratrici possano ispirarsi a lei positivamente. Per questa ragione rifiutò alcuni ruoli quali Wendy in Tempesta di ghiaccio (1997) di Ang Lee, (poi affidata a Christina Ricci), Lolita (1997) di Adrian Lyne. Venne scartata per il casting di Romeo+Giulietta (1998) di Baz Luhrmann, in quanto rispetto a Leonardo Di Caprio sembrava troppo piccola d'età (è alta 1,60 m) e questo secondo gli autori avrebbe potuto compromettere la credibilità del ruolo.
Rientra nel mondo del cinema interpretando la Regina Amidala nel primo episodio di Star Wars Episodio I - La minaccia fantasma (1999) di George Lucas, per il quale ottiene un immediato successo e, nello stesso anno, riceve la parte da protagonista in La mia adorabile nemica (1999) di Wayne Wang, in cui recita al fianco di Susan Sarandon.
Nel 2002 continua con Star Wars Episodio II - L'attacco dei cloni in cui interpreta la senatrice Amidala. Nel film sboccia un amore fra il suo personaggio (Padme Amidala) e Anakin Skywalker, interpretato dal giovane attore Hayden Christensen.
Nel 2003 si laurea in psicologia dopo essere comparsa in Ritorno a Cold Mountain.
Continua ad avere successo apparendo in diversi film di buon livello, come La mia vita a Garden State (2004) di Zach Braff fino ad arrivare alla sua brillante interpretazione in Closer (2004) per cui guadagna un Golden Globe e una nomination all'Oscar.
Conclude finalmente la saga di George Lucas con il terzo episodio di Star Wars Episodio III - La vendetta dei Sith (2005), in cui appare sempre come la senatrice Amidala, ma questa volta innamorata e molto sofferente.